钱教授，您好！又有几个问题向您请教：1、重组质粒用PAC1酶切后直接用柱子纯化，而不割胶纯化，这样可以吗？您是怎样来做这一步的？2、转染后怎么鉴定是否转染成功，CMV-LACZ转染在两天后用试剂盒染色，如果染为兰色是否可以说明我的基因转染成功。我的基因是不带有GFP荧光蛋白的，用转染后细胞免疫组化可以鉴定吗？流式细胞术可以鉴定吗？3、重组的质粒还需要拿去测序吗？我的目的基因是自己克隆的，在一系列的操作过程中是否可能会发生变化？多谢！！钱老师:您好! 问您一个较低级的问题,我想让plxsn-Lac Z通过破坏的血脑屏障并在脑中表达,能做到么?如果能的话,对plxsn-Lac Z我该怎么处理?希望您在百忙之中一定回答,谢谢!!我想请问一下，真菌在肿瘤基因治疗中可能扮演的角色？钱老师，我马上就做基因治疗和载体方面的 报告了。有些知识还不太懂，这里请教您几个问题：1，腺病毒载体目前发展到第几代了。2，这几代之间的区别是什么，有什么改进。3，腺病毒载体研究的趋势。（是感染效率，靶向性，安全性，以及表达的长久性吗？）最后一个不知道如何表达，表达的有点模糊了。不好意思。麻烦您了。ONYX-015在正常细胞中也有增殖可能,因此具有潜在的致瘤性.鉴于此,美国ONYX公司已2003年月停止对ONYX-015的继续研发,并解聘了80多名相应员工.钱教授： 您好！我是一名刚刚进入基因治疗领域的研究生，对这一领域还不了解，因此急切想知道这一领域的研究动态，目前世界上都有哪些大学和研究所，哪些科学家在研究，他们的主攻方向是什么，有什么突破性进展没有？哪里做得最好？国内的相应情况又如何呢？和国外的差距主要体现在哪里？非常期待您的解答！谢谢！！钱老师，你好。我是血研所的。我想聆听您关于慢病毒方面的见解。谢谢。钱教授，你好，我有一个问题一直困扰着我，就是我用AD293细胞包装好的腺病毒颗粒去感染细胞后，腺病毒表达的外源蛋白在什么位置，我有三种疑虑：1、是否作为腺病毒的结构蛋白的一部分？2、是否附着在腺病毒的表面？3、是否游离在腺病毒之外，如胞浆和胞外？我的观点是外源蛋白游离在胞浆，不知是否正确，望钱教授在百忙之中给我指点迷津，非常感谢，如有此方面的文献更好。Email: [email protected].有无增殖病毒和恶性黑素瘤方面的研究进展请钱教授谈一谈恶性黑素瘤基因治疗的研究进展钱教授和的各位老师们好！在下目前准备做心肌缺血的基因治疗方面的课题。从各方面了解到病毒载体用重组腺相关病毒较好，也拜读了吴小兵博士的一些文章，感觉受益很大。目前准备是3质粒（重组了VEGF的AAV、2个helper）磷酸钙共转染系统，以293T为包装细胞，用氯仿/PEG/NaCl系统纯化。现有一些问题想请教老师们，还忘不吝赐教！我有同学现在做重组腺病毒，他包装完第一批后，就用所得的病毒继续1：3~4转染293细胞，继续提取病毒。腺相关病毒可以这样做吗？我老是感觉不太行，因为也没看到有关的文献什么的，而且复制效率、能否在293细胞中继续合成等。但有的老师说因为已经包装成了完整的病毒颗粒就可以这样做。我想请教各位老师腺相关病毒是否每次都需质粒包装呢？可以告诉我原因或者在哪儿能找到相关文献吗？ 钱教授和各位老师每天工作一定很忙，也许难得有时间回复给我。但这件事对我来说真的很重要，也许牵扯到我能否毕业的问题，还万望各位老师能在百忙中抽点时间给与回复，不胜感激！ 再次拜谢！钱教授，您好！ 我们的实验在将一个多片段的双链RNA病毒导入细胞内遇到了一些困难，您能否给一下建议，要同时导入含有多个3kb左右双链RNA的病毒（细胞本身没有该病毒的受体），用什么方法比较好。 如钱教授及各位老师能给予回复，不胜感激！钱老师，想问一下在您看来，腺病毒、逆转录病毒、AAV、慢病毒在运载小分子（如siRNA）进入细胞并稳定表达（至少达到治疗效果）方面，哪一个更有发展前景？最近实在是太忙了，要么出差在外，要么每天都有很多东西要写，基因治疗药SG600-P53报批临床资料、SGCPI治疗的30例临床总结、863汇报、申报上海市一等奖、申请一些专利等等，还有一个中国数字图书馆国家公众健康分馆的大型网站的策划，占了我太多时间，实在不太好意思有这么多问题没有回答，请各位谅解。meagie wrote:钱老师，想问一下在您看来，腺病毒、逆转录病毒、AAV、慢病毒在运载小分子（如siRNA）进入细胞并稳定表达（至少达到治疗效果）方面，哪一个更有发展前景？这主要看靶细胞是什么，不同的靶细胞可能需要采用不同的载体系统。lancychen wrote:钱教授，您好！ 我们的实验在将一个多片段的双链RNA病毒导入细胞内遇到了一些困难，您能否给一下建议，要同时导入含有多个3kb左右双链RNA的病毒（细胞本身没有该病毒的受体），用什么方法比较好。 如钱教授及各位老师能给予回复，不胜感激！可以考虑脂质体转染mmx_0 wrote:钱教授和的各位老师们好！在下目前准备做心肌缺血的基因治疗方面的课题。从各方面了解到病毒载体用重组腺相关病毒较好，也拜读了吴小兵博士的一些文章，感觉受益很大。目前准备是3质粒（重组了VEGF的AAV、2个helper）磷酸钙共转染系统，以293T为包装细胞，用氯仿/PEG/NaCl系统纯化。现有一些问题想请教老师们，还忘不吝赐教！我有同学现在做重组腺病毒，他包装完第一批后，就用所得的病毒继续1：3~4转染293细胞，继续提取病毒。腺相关病毒可以这样做吗？我老是感觉不太行，因为也没看到有关的文献什么的，而且复制效率、能否在293细胞中继续合成等。但有的老师说因为已经包装成了完整的病毒颗粒就可以这样做。我想请教各位老师腺相关病毒是否每次都需质粒包装呢？可以告诉我原因或者在哪儿能找到相关文献吗？ 钱教授和各位老师每天工作一定很忙，也许难得有时间回复给我。但这件事对我来说真的很重要，也许牵扯到我能否毕业的问题，还万望各位老师能在百忙中抽点时间给与回复，不胜感激！ 再次拜谢！腺病毒可以转染293细胞再复制出腺病毒，是因为在293中含第一代腺病毒缺失的区域即E1区。而AAV则不行，因为293中无AAV所需要的rep、Cap、E2a、E4区等等，故单独的AAV不能在293中复制，如需要AAV复制，需要提供含上述基因的辅毒或辅助载体。我爱思维 wrote:有无增殖病毒和恶性黑素瘤方面的研究进展请钱教授谈一谈恶性黑素瘤基因治疗的研究进展 这方面的文章很多，你只要用medline稍微搜索一下，可以看到很多文章shangyongzheng wrote:钱教授，你好，我有一个问题一直困扰着我，就是我用AD293细胞包装好的腺病毒颗粒去感染细胞后，腺病毒表达的外源蛋白在什么位置，我有三种疑虑：1、是否作为腺病毒的结构蛋白的一部分？2、是否附着在腺病毒的表面？3、是否游离在腺病毒之外，如胞浆和胞外？我的观点是外源蛋白游离在胞浆，不知是否正确，望钱教授在百忙之中给我指点迷津，非常感谢，如有此方面的文献更好。Email: [email protected].通常的腺病毒载体在E1插入外源基因，其表达蛋白不会作为腺病毒的结构蛋白的一部分，也不会附着在腺病毒的表面，至于这个蛋白在胞浆内、分泌在胞外还是在细胞核中，这个这个蛋白质的信号肽有关，不同的信号肽可使蛋白质定位于细胞的不同部位，如果使蛋白成为腺病毒的结构蛋白的一部分，必须与腺病毒的结构蛋白进行融合基因表达。heavenlily wrote:ONYX-015在正常细胞中也有增殖可能,因此具有潜在的致瘤性.鉴于此,美国ONYX公司已2003年月停止对ONYX-015的继续研发,并解聘了80多名相应员工.ONYX-015在正常细胞中也有一定的增殖能力，但决无致瘤性，这是因汲ONYX-015是2型与5型的嵌合腺病毒，目前所有证据都表明即使是2型与5型的野生型腺病毒亦无致瘤性。铃声 wrote:钱老师，我马上就做基因治疗和载体方面的 报告了。有些知识还不太懂，这里请教您几个问题：1，腺病毒载体目前发展到第几代了。2，这几代之间的区别是什么，有什么改进。3，腺病毒载体研究的趋势。（是感染效率，靶向性，安全性，以及表达的长久性吗？）最后一个不知道如何表达，表达的有点模糊了。不好意思。麻烦您了。腺病毒应分为三代，第一代是E1缺失伴有或不伴有E3缺失，第二代在上述基础伴E2或E4区缺失，第三代只含有两个ITR及一个包装信号，所有腺病毒的病毒蛋白基因都缺失。从你的来信中可以了解你刚刚开始做实验，我想你可能需要到经常做基因治疗实验室进行培训。所谓载体都可以在大肠杆菌中扩增，慢病毒载体也不例外，所以你只要将含有载体滤纸剪下，浸泡在TE中，半小时-1小时后转化Ecoli即可。293T该细胞是G418抗性的，是因为含neo基因的载体，将无G418时，该载体因细胞分裂而丧失，因此必须用G418筛选而稳定的阳性克隆时，该细胞株才含有该载体，这才真正意义上的293T。xingjian wrote:>钱老师：您好！> > 我做有关RNAi方面的课题，所需慢病毒载体有国外惠赠，但我对存放在滤纸上的载体提取束手无策。> > 询问他人，说法不一，因为没有人提取过慢病毒载体。> > 我的导师对此也不甚清楚，建议我搜索有关知识，可是很难得到可靠的资料。> > 看了您的帖子，得知您对该方面造诣不凡，故特此请教。> > 1.您能否提供一些有关资料？文章、链接、方案等都可以。> > 2.如果您很忙，那么，您只回答这一条也可以，就是：不同载体的宿主细胞是否也不一样？我看到腺病毒载体的提取扩增是都用感受态大肠杆菌的。慢病毒载体是否也可以用感受态大肠杆菌？> > 3.从国外寄来的资料上，提到包装细胞系用的是293T,可是，通过阅读文献发现，该细胞是G418抗性的，而在后面筛选稳定的阳性克隆时，却要用到G418，这是否有些矛盾（即使未转染的细胞也可以G418抗性）？> > 如果上述属实，那么，我是否可以改为293细胞作为包装细胞？> > 敬请钱老师百忙之中解答。首先在此表示感谢！>请问钱教授，应用启动子调控tk基因这方面的研究国内很多么，有无前途请钱教授谈谈HSV载体在中枢神经系统应用的免疫原性问题！多谢！钱教授，您好！我最近从国外要了一个已有目的基因的载体，氨苄抗性，不知何故，转化了多次均告失败。不知问题在哪里，盼钱教授能给予指导。谢谢！！钱教授，您好！就您所知，已经进入临床试验或应用于临床（如今又生）的腺病毒药物，是否会引起肺纤维化，肝纤维化等副作用。谢谢钱教授您好: 我刚来到这个论坛,真的很激动,有这么多热门的问题大家可以一起交流讨论啊. 我现在的课题是,用慢病毒(HIV-1)作为载体,转如热休克蛋白70(HSP70)与营养因子ＧＤＮＦ同时表达，我不知道，钱教授是否接触过慢病毒，我想问您是否了解这样的表达是否可以，还有就是ＨＳＰ７０主要对肿瘤的治疗很显著，但对脑内神经系统是否有效呢，我查了一些资料，国外有这方面的报道，不知道钱教授有哪些不同的见解？？？？　　谢谢！dlwangjg wrote:请问钱教授，应用启动子调控tk基因这方面的研究国内很多么，有无前途这方面己研究很多，国内主要集中于AFP皮CEA启动子，国外几乎所有的肿瘤细胞相关启动子都有报道。主要所谓特异性的启动子都是相对的，其次特异性的启动子的活性明显低于通常应用强启动子如CMV。因此这方面可以做一些研究，主要寻找一些更加特异性及有加有效的启动子，当然针对肿瘤广谱的就更好了。jazz0331 wrote:钱教授，您好！就您所知，已经进入临床试验或应用于临床（如今又生）的腺病毒药物，是否会引起肺纤维化，肝纤维化等副作用。谢谢应当不会引起肺纤维化，肝纤维化等副作用吧。钱教授我是临床系的学生，但目前课题与多基因病的致病基因筛查有关，在读文献及进行课题思考时遇到一些问题，恳请百忙中解答：今天读文献，看到有这么一段：”采用序贯分析的方法对若干家系的资料进行累加可得到显著的LOD值支持或反对“这句话是什么意思？是否是说对某一个疾病的多个家系进行连锁分析时，对同一位点所取得的LOD值最后要全部加在一起再算出总LOD值呢？如果这样的话，单纯增加家系数目不就可以得到较大的LOD值了么？上述理解是否有误？希望指导。 还有：在美，盖莱哈特编的医学遗传学原理第九章谈到LOD值时有这么一段：“将一组非亲缘家系研究中获得的连锁数据结合起来通常是有意义的。由于在这些单独家系中连锁似然性是独立的，可用这些值的乘积联合确定似然性。记住LOD值是似然性比率以10为底的对数，而且lg（A等于lg（A)+lg(.因此，从单个家系获得的LOD值本身可以简单的加以计算总的LOD值。在某些研究中，虽然任一个单一家系LOD值本身不可能达到这个值，总的LOD值可以满足统计学显著性的标准。”在以上这一段话中，也谈到了LOD的合并问题。这是否是说，如果说我扫多个家系，在同一个Mark情况下都扫到了正值，虽然这个正值比较小，但是，可以多个叠加起来，可能会有》3的情况出现。这是这样理解的么?钱教授，您好！以前请教过您好多问题，对您的精辟而耐心的回答表示最真诚的感谢！我是做腺病毒载体的，目前我把构建好的载体送去测序，结果显示在700bp的位置插入了一个碱基A,还有3处碱基置换，多插入的碱基A引起了移码突变，我有几个问题想请教：1.在构建腺病毒载体的过程中，能够引起碱基突变的步骤主要是哪几步？我知道高保真酶扩增时会引起突变，那么我想知道在BJ5183细胞内同源重组和在DH5a菌内多次扩增容易引起碱基的突变吗？2.如何看待测序的结果，因为在我的结果中有碱基插入的部位反向和正向的位置都超过500bp,而且本来有9个A的，测序结果中有10个，多了一个，根据您的经验这样的结果很可信吗？3.如何评价碱基置换后对于蛋白质结构域的影响？多谢！在构建腺病毒载体过程中通常不会突变,更不会象你所说那样出现多次突变,我的理解主要你的测序出了问题,我们认为测序只有98%的可靠性,在测序刚开始的50-70碱基,以及600个以后碱基可能都有比较大的误差,当然其误差率与不同测序的公司也有关系,因此我们比较强调双向测序以减少误差率,因此,建议你对你原质粒及病毒载体都进行双向测序.BJ5183是一个重组菌,主要是进行同源重组,它可能会使大质粒发生重组,从而变成另一个质粒.但突变质粒并不高.当然,如碱基突变导致AA发生变化,这肯定影响结果.雨晨 wrote:钱教授，您好！以前请教过您好多问题，对您的精辟而耐心的回答表示最真诚的感谢！我是做腺病毒载体的，目前我把构建好的载体送去测序，结果显示在700bp的位置插入了一个碱基A,还有3处碱基置换，多插入的碱基A引起了移码突变，我有几个问题想请教：1.在构建腺病毒载体的过程中，能够引起碱基突变的步骤主要是哪几步？我知道高保真酶扩增时会引起突变，那么我想知道在BJ5183细胞内同源重组和在DH5a菌内多次扩增容易引起碱基的突变吗？2.如何看待测序的结果，因为在我的结果中有碱基插入的部位反向和正向的位置都超过500bp,而且本来有9个A的，测序结果中有10个，多了一个，根据您的经验这样的结果很可信吗？3.如何评价碱基置换后对于蛋白质结构域的影响？多谢！钱教授好： 从前短时间的帖子看，现在国内做基因治疗的载体仍是以腺病毒为主，而腺病毒但国外似乎更见好的是马传染性贫血病转移载体（EIAV）在治疗人的神经性疾病以及构建转基因动物，包括猪、鸡和鹌鹑等方面的应用。我想知道以治疗为目的，和以建立生物反应器为目的有何区别？NationAll 你好！ 目前，我也正在探讨超声波结合微气泡转基因治疗的可行性。 我想与你交流一下经验，请问怎么联系你呢？ 我的e－mail：[email protected]大灵通: 你好！ 我现在正打算做基因治疗方面的实验，急需抗凋亡基因Bcl-2的重组体"PLXSN-Bcl-2"，请问你 在什么地方买到的抗凋亡基因Bcl-2的重组体"PLXSN-Bcl-2“的呢？同时也想获得一些实验经验。 盼回复